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  • Claudia Oña & Erick Moreta

Olfato molecular y diagnóstico con CRISPR

CRISPR-Cas es una de las tecnologías más usadas en la edición genética. Esta herramienta es una adaptación de una especie de "sistema inmune", o de defensa de algunas bacterias frente a otros microorganismos. Estas capturan fragmentos de ADN de los virus que las infectan y los usan para crear repeticiones de pedacitos de este material, que reciben el nombre de "repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas" (CRISPR, por sus siglas en inglés), mismas que incorporan en su genoma (Hilli & Charpentier, 2016).



Dichas secuencias de ADN permiten que las bacterias “recuerden” a los virus si los atacan de nuevo. A partir de este sistema se sintetiza un fragmento de ARN, que funciona como una guía molecular, la cual dirigirá a una enzima o catalizador biológico conocida como Cas. Esta última corta el ADN intruso de los virus (Wong, Liu, & Wang, 2015). Una forma sencilla de describir este sistema es que actúa como si fuese unas tijeras moleculares “teledirigidas” que podían ser programables al modificar su guía.




Los investigadores no tardaron en ver su aplicabilidad en la edición genética, es decir, la posibilidad de modificar el código genético de los seres vivos con el fin de obtener resultados específicos, ya sea para la modificación de organismos con fines de remediación de suelos contaminados, modificación de características deseables en plantas, o incluso, tratamientos para enfermedades congénitas.


¿Cuál es el procedimiento general para hacerlo? Para ello, los científicos diseñan una secuencia de ARN guía que se complementa con la secuencia de ADN que se desea editar. Posteriormente introducen a la enzima Cas9 (la más usada), la cual corta la doble cadena del ADN en la secuencia especifica. La rotura de la doble cadena se repara por medio del metabolismo de la célula en donde se aprovecha para introducir o eliminar secuencias de ADN (Hilli & Charpentier, 2016). A pesar de que CRISPR se ha vinculado principalmente a la edición genética, esta herramienta ha servido para desempeñar otro tipo de aplicaciones, como las que se detallan a continuación.


Un primer tipo de aplicación diferente a la de edición genética, es la detección de ADN y/o ARN, como por ejemplo, para el diagnóstico de enfermedades humanas o de patógenos agrícolas sin la necesidad de equipos sofisticados ni personal especializado para la interpretación de resultados. Una de las plataformas más conocidas en detección de ácidos nucleicos mediante el uso de CRISPR es SHERLOCK. La cual, de forma general, emplea dos proteínas parecidas a Cas9 denominadas Cas12 y Cas13 para detectar ADN y ARN respectivamente (Labun, y otros, 2019). Con la adición de un ARN guía, ambas proteínas tienen la cualidad de reconocer una determinada secuencia de interés para cortarla. Cuando esto sucede se enciende una actividad nucleasa no específica (Abudayyeh, 2016), esto quiere decir que Cas12 y 13 cortarán cualquier ácido nucleico que se encuentre cerca, propiedad que carece la enzima Cas9. Esta última propiedad es utilizada para poder realizar detección de moléculas mediante sistemas CRISPR.



En esta plataforma se diseñan y añaden pequeños fragmentos de ADN que poseen en un extremo un fluoróforo, o compuesto que genera fluorescencia, y en el otro un apagador. En el caso de haber una secuencia complementaria al ARN guía, la proteína Cas activa su función de nucleasa (tijera de ácidos nucleicos) de forma inespecífica y cortará los fragmentos de ADN modificados haciendo que el fluoróforo se separe de su apagador y emita una señal de fluorescencia (Kellner, Koob, Gootenberg, Abudayyeh, & Zhang, 2019). De no haber la secuencia complementaria, ninguna fluorescencia sería emitida. El uso de esta plataforma se está implementando en el diagnóstico de muchos patógenos, incluyendo al patógeno de interés actual: SARS CoV-2 (Joung, y otros, 2020).


Ahora bien, CRISPR también ha servido como herramienta para la creación de un “olfato molecular”. El sistema para poder detectar moléculas de distinta naturaleza se llama CaT-SMELOR. Este usa un elemento adicional a los componentes ya expuestos en SHERLOCK: proteínas que tienen la capacidad de unirse al ADN llamadas factores de transcripción. Los factores de transcripción usados en CaT-SMELOR tienen la cualidad de reaccionar con una determinada molécula ocasionando que pierda su afinidad por el ADN. Una vez suelto del factor de transcripción, el ADN se libera de la molécula y puede reaccionar con la proteína Cas12 y desencadenar el resto de las reacciones ya detalladas en SHERLOCK. En el sistema SMELOR, los diferentes factores de transcripción serán los que definen qué molécula se quiere detectar más no el ARN guía. Este sistema ya se ha probado en diferentes moléculas como el ácido úrico diluido en agua e incluso en sangre. SMELOR se presenta como un sistema que puede ser aplicado en la detección de contaminantes, diagnóstico de enfermedades, calidad de alimentos, entre otros (Liang, y otros, 2019).



Cuando CRISPR fue descubierto, por el científico español Francisco Mojica, en la Universidad de Alicante, a partir de sus estudios en microorganismos que resistían las temperaturas elevadas de fuentes termales, su potencial en la edición genética fue explotado, especialmente gracias al trabajo de Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna, quienes recibieron por ello el Premio Nobel de Química el día de hoy (7 de octubre, 2020). El sistema presentó una forma de modificar casi cualquier organismo y ha sido conocido principalmente por este papel. Sin embargo, CRISPR-Cas ha demostrado ser una herramienta versátil que puede ir más allá de la edición genética y expandirse a muchos otros campos.


Francisco Mojica, Emmanuelle Charpentier (Premio Nobel Química 2020) y Jennifer Doudna (Premio Nobel Química 2020)

Referencias


Abudayyeh, O. (2016). C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science, 353.


Hilli, F., & Charpentier, E. (2016). CRISPR-Cas: biology, mechanisms and relevance. Phil. Trans. R. Soc., 1-12. doi:DOI: 10.1098/rstb.2015.0496


Joung, J., Ladha, A., Saito, M., Segel, M., Bruneau, R., Huang, M. W., . . . Zhang, F. (2020). Point-of-care testing for COVID-19 using SHERLOCK diagnostics. medRxiv.Preprint. doi: 10.1101/2020.05.04.20091231


Kellner, M., Koob, J., Gootenberg, J., Abudayyeh, O., & Zhang, F. (2019). SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR. Nature Protocols. doi:https://doi.org/10.1038/s41596-019-0210-2


Labun, K., Montague, T., Krause, M., Torres-Cleuren, Y., Tjeldnes, H., & Valen, E. (2019). CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research, 171-174. doi:https://doi.org/10.1093/nar/gkz365


Liang, M., Li, Z., Wang, W., Liu, J., Liu, L., Zhu, G., . . . Wang, K. (2019). A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for. Nature Communications. doi:https://doi.org/10.1038/s41467-019-11648-1


Wong, N., Liu, W., & Wang, X. (2015). Characteristics of functionalguide RNAs for the CRISPR/Cas9 system. Genome biology. doi:DOI: 10.1186/s13059-015-0784-0

Imágenes: Adobe Stock; BioRender; Imagen Final Francisco Mojica, Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna, Ilustración: Diana Mollocana




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